Spelet äger rum på den tropiska semesterorten Isle Delfino, som är formad som en delfin och omfattar tio primära platser. Ön är huvudsakligen bebos av tävlingarna Piantas och Nokis. Delfino Plaza är Isle Delfino huvudstad och spelets huvudsakliga nav. Mario anges för Isle Delfino för en semester med prinsessan Peach, hennes långa tid steward Toadsworth, och några andra paddor, hoppas på en avkopplande semester. Vid ankomsten, de finner att en gång orörda ön har förorenats och putsade med graffiti. Som ett resultat av denna förorening, sol-formade objekt som kallas "Shine Sprites", öns kraftkällor, har försvunnit, och ön är täckt av en evig skugga. Gärningsmannen sett sprida graffiti är förklädd till Mario (kallad "Shadow Mario"). Mario omgående greps när han anländer, falskt anklagad för vandalisering ön. Han ställs inför rätta, befunnits skyldig, och beordrades att städa upp graffiti och återställa Shine Sprites. För att hjälpa till med städning, Mario finner Fludd, en kraftfull vattenkanon som toted som en ryggsäck. Mario ger sig ut på ett äventyr för att rentvå sitt namn och leta reda på verkliga kriminella, samtidigt återställa lugn och ordning till Isle Delfino.
Kommentarer hittades inte